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実験医学別冊 達人に訊くバイオ画像取得と定量解析Q&A 顕微鏡の設定からImageJによる解析・自動化まで

  • ISBN : 9784758122504
  • ページ数 : 220頁
  • 書籍発行日 : 2021年3月
  • 電子版発売日 : 2021年4月21日
  • 判 : B5判
  • 種別 : eBook版 → 詳細はこちら
販売価格 (ダウンロード販売)
¥5,720 (税込)
ポイント : 104 pt (2%)

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商品情報

顕微鏡観察像の定量データ解析に課題を抱えていませんか.観察・解析に際しての疑問や悩みに,初学者の課題に向き合ってきた執筆陣が基礎から答えます.あなたもImageJを使いこなして望むデータを得ましょう!

※本製品はPCでの閲覧も可能です。
製品のご購入後、「購入済ライセンス一覧」より、オンライン環境で閲覧可能なPDF版をご覧いただけます。詳細はこちらでご確認ください。
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■ 序文

はじめに

近年,実験系の生物学において,データ科学の勃興ならびに顕微観察技術の発展にあわせ,定量的な画像解析の需要がますます高まっています.その一方で,生物学分野に特化した画像取得からデータ解析につながる一連の技術体系は構築過程の只中にあり,これを学ぶ機会を得ることは大学教育を含め難しい状況となっています.

これまで,我々は「生物画像データ解析トレーニングコース」と銘打ち,画像処理・解析の導入段階にある生物学研究者を対象とした講習会を毎年開催してきました.本会では,生物画像処理・解析用ソフトウェアの代表格であるImageJ/Fiji を用いた初歩的な画像処理・解析について実習・講義を実施しており,学生からPI の研究者まで幅広く参加いただいています.ImageJ/Fiji はその機能性の高さの一方,自由なソフトウェアとして無料で公開され,広範の支持を得ています.この会は,可能な限り実践的であることを目指し,その一環として受講者各自が実際に研究対象としている画像を持ち寄りその解析法について皆で議論する場を設けています.これまで扱った画像は生物学全般をはじめ食品など多岐にわたり,解析の目的や,その技法も多様なものとなりました.本書では,本会でこれまで交わされた様々な議論について一般性の高いものを抽出し,紙上で再現することを目指してQ & A の形式を採ることとしています.

生物画像解析では,撮像条件を最適化することでより簡単に解析を行うことができる場合が多くあります.そこで,本書では画像解析に適した画像の取得のための顕微観察法の選択や撮像条件の設定,そして試料の調製法について解説します.次に,画像の特徴を計測するための基本的な技法や適用対象について紹介します.さらに,解析過程において避けることのできない画像の改変についてどのような問題が発生し,それらにいかに対処するべきかについて,過去に我々が目にした事例をもとに現時点で考えられる方策について議論します.このような画像解析の過程は,複数の処理工程から成立します.この過程を自動化するために避けては通ることができないプログラミング技法について,ImageJ/Fiji の簡易的なプログラミング環境であるマクロを用いた方法を解説し,たくさんの画像を対象に簡単に測定を行う方法について紹介します.また,画像処理・解析の技術面だけでなく,これらを実施する上で留意すると良い注意事項についてもとりあげました.解析の過程は,画像の中から計り取るべき点を的確に設定し,生物学的に意味のある数値として抽出する作業です.ここでは,研究者自身がこれまでに構築した生物学的知識を生かし,個別の実験環境ごとに単純な処理工程を柔軟に組み合わせ適用する方法が功を奏することが多々みられます.本書では,このような視点から読者が自ずから解析できるようになることを目指しています.

本書の礎となった「生物画像データ解析トレーニングコース」の開催に際し,木森義隆先生,安永卓先生,塚田祐基先生,朽名夏麿先生,内田誠一先生ならびに内田研究室から例年お越しくださったTeaching assistant(TA)諸氏,基礎生物学研究所の西出浩世さん,市川千秋さん,斎田美佐子さん,加藤愛さん,光学解析室メンバーをはじめ多くの方々のご尽力をいただきました.また,上野直人先生,藤森俊彦先生,高田慎治先生には会のスーパーバイザーとしてご指導いただき,そして受講者の方々は毎年活発な議論を喚起してくださいました.また,本書の上梓にあたり羊土社の高木亮輔さん,本多正徳さんには多大なる御助力を頂戴しました.この場を借りて感謝を申し上げます.本書が,生物学研究に携わる方々の課題を解決する上での足掛かりとならんことを願っております.


2021 年3 月

加藤 輝,小山宏史

■ 目次

第Ⅰ部 顕微鏡観察

第1章 顕微鏡・画像の基礎

Q1 カラーカメラと白黒カメラの使い分けを教えてください.【村田 隆】

Q2 いろいろな種類のカメラがありますが,何が違っていてどのように使い分ける必要があるのでしょうか?【坂本 丞】

Q3 共焦点顕微鏡はどのようなカメラで撮っていますか?【亀井保博】

Q4 二光子顕微鏡は何が利点ですか?また,使い分けについて教えてください.【亀井保博】

Q5 顕微鏡画像のピクセルは細かいほどよいのでしょうか?【村田 隆】

Q6 8 bit画像と12 bit画像の違いは何でしょうか.画像取得ではどちらを使えばよいのでしょうか?【村田 隆】

Q7 LUTとは何のことでしょうか.【村田 隆】

Q8 共焦点顕微鏡で撮影したらGFPが緑色,RFPが赤色の画像が表示されました.表示色を変えてもよいのでしょうか?【村田 隆】

Q9 撮影した画像はtiff形式で保存するのがよいですか?【村田 隆】

Q10 レビュワーから三次元画像解析データを求められましたが,大学内にも三次元撮影できる顕微鏡はないです.どこかで借りられますか?【亀井保博,加藤 輝】

第2章 画像解析のための顕微鏡観察法

Q11 画像解析する前にあらかじめ確認しておくべき基本的かつ一般的な事柄は何かありますか?【亀井保博】

Q12 タンパク質の標識などに蛍光物質をよく使いますが,そもそも蛍光とは何ですか?【亀井保博】

Q13 蛍光物質には大きく分けると蛍光色素と蛍光タンパク質の2種類があると聞きましたが,両者の違いと使い分けを教えてほしいです.【亀井保博】

Q14 GFPを発現させた培養細胞の画像を撮影して輝度測定を行う予定です.どのような機材が必要でしょうか.【村田 隆】

Q15 遺伝子発現量(プロモーター活性)を蛍光画像から定量したいです.注意点は何ですか?【亀井保博】

Q16 弱い蛍光を経時的に定量したいですが,退色が速いです.どうしたらいいですか?【亀井保博】

Q17 免疫染色したサンプル間で1細胞あたりのタンパク質の発現量を比較したいのですが,注意する点は何ですか?【坂本 丞】

Q18 蛍光物質で細胞内の物理パラメータの変化(pHやカルシウムイオン濃度など)を測定している論文がありますが,どのような原理や方法で定量しているのでしょうか?【坂本 丞】

Q19 蛍光寿命イメージングとは何ですか? 退色のことですか?【亀井保博】

Q20 さまざまな観察法のうち,培養細胞の計数を自動化するのに適した手法は何でしょうか?【坂本 丞,谷口篤史】

Q21 生体(胚)の細胞系譜解析(細胞トラッキング)を行いたいのですが,どのような撮影法がありますか?【村田 隆】

Q22 透明化試料を観察したいのですが,イメージングで気をつけることはありますか.【野中茂紀】

第3章 顕微鏡観察の工夫

Q23 自分の顕微鏡で輝度定量が正しくできるのか心配です.どのように確かめたらよいでしょうか.【村田 隆】

Q24 厚みのある試料で輝度定量する場合の注意点を教えてください.【村田 隆】

Q25 立体物の形状を評価したいのでZスタックから再構成画像を作ったのですが,画像が細長く伸びているようです.何が問題なのでしょうか.【村田 隆】

Q26 FRETセンサーを用いた計測を行いたいのですが,色素によって退色速度が異なるようです.どのように扱えばいいですか?【坂本 丞】

Q27 画像の中央とへりで背景の明るさが違うようです.どうすればよいでしょうか?【村田 隆】

Q28 マルチカラー(複数の蛍光タンパク質など)で共局在を調べたいのですが,毎回撮影した画像の辺縁部だけが共局在しません.なぜでしょうか?【亀井保博】

Q29 タイムラプス画像で位置のずれが生じてしまうのですが補正できないでしょうか.あるいは,ブレの補正のために試料側でできることはありますか.【谷口篤史】

Q30 植物サンプルの長時間タイムラプス撮影を行いたいのですが,撮影以外の時間は光を当てておく必要があります.どうしたらいいですか?【坂本 丞】

第Ⅱ部 画像解析

第1章 画像解析・ImageJの基礎と概念

Q31 たくさんの画像をもっているのですが,何か計測できませんか? 例えば,野生型と変異体から取得した画像があるのですが,何かの差を定量的に評価できませんか?【小山宏史】

Q32 ImageJのメニューにある画像処理法をそのまま使えば,一貫性(再現性,客観性)のある画像解析を実現できますか?【小山宏史】

Q33 手作業で定量すると客観性が失われそうですが,コンピュータの画像処理法を用いれば,客観的な定量が実現できますか?【小山宏史】

Q34 自分で作成した画像処理法によって正しい結果が得られているかはどのように判定すればいいですか?【小山宏史】

Q35 画像処理によって,人の目では見えなかったものを見えるようにすることはできますか?【小山宏史】

Q36 コンピュータに構造物を認識させるとはどういうことですか?【小山宏史】

Q37 画像処理といえば,通常コンピュータに処理させることを指すと思いますが,人ではできないことは何ですか?【小山宏史】

Q38 結局,画像処理は何を行っているのですか?【小山宏史】

Q39 画像処理ってデータの改竄と同じではないですか?【小山宏史】

Q40 画像処理に求めてはいけないことはどんなことがありますか?【小山宏史】

Q41 画像処理において誤用の危険性がある代表的な処理を教えてください.【小山宏史】

Q42 画像処理について勉強したいのですが,画像工学の書籍を見ると生物研究には使わなさそうな内容が多いように感じてしまい,学習意欲がわきません.何かよい勉強法はないでしょうか.【小山宏史】

Q43 輝度を定量するときに気を付けるべき点はどのようなことですか?【村田 隆】

Q44 共焦点顕微鏡で得られた連続断層画像を使って輝度を比較するには,どのような評価法を用いるべきですか?【村田 隆】

Q45 撮影した画像に暗い部分と明るい部分があり,両方を示そうとするとどちらかが暗くなったり明るくなったりして見にくいです.どうしたらよいでしょうか.【村田 隆】

Q46 ImageJの機能によっては16 bitに対応していないものがあるようです.8 bitに変換したいのですが何か注意点はありますか?【小山宏史】

Q47 顕微鏡画像がImageJや市販のソフトウェアで開けません.なぜでしょうか?【村田 隆】

Q48 ImageJとFijiはどう違いますか?【村田 隆】

Q49 ImageJのマクロとプラグインはどのような違いがあるのでしょうか?【坂本 丞】

第2章 ImageJによる定量解析

Q50 画像処理で2値化を行い,対象物を抽出したいのですがうまくいきません.よいアイデアはありますか.【村田 隆】

Q51 2値化するときに,Auto thresholdの項目を見るとたくさんの方法が列挙されています.どれを選んだらいいですか?【小山宏史】

Q52 カラー画像を2値化して対象を抽出したいのですが,グレースケール画像に変換してから2値化するとうまくいきません.どうにかなりませんか.【野中茂紀】

Q53 閾値法(Threshold)で処理したり,2値化画像に対してBinaryフィルタ処理をすると,白と黒の挙動が期待と逆になることがあります.どうすれば直りますか.【谷口篤史】

Q54 スタック画像について各スライスを一括で2値化したいのですが,閾値(threshold)がスライスごとに勝手に変わってしまいます.どうすれば同じ値で処理できますか?【谷口篤史】

Q55 背景を除去するための処理法としてどういった方法がありますか? ImageJではRolling ball法という処理があると聞きましたが有効ですか?【小山宏史】

Q56 背景が複雑な画像から目的の構造物だけを抽出したいのですが,閾値を設定してもうまくいきません.いい方法はありますか?【小山宏史】

Q57 繊毛や血流など動く成分だけをとり出せないでしょうか.【野中茂紀】

Q58 バックグラウンドが高め(全体的に自家蛍光がありそう)なサンプルなのですが,バックグラウンドを全体から引けば輝度定量をしてもよいですか?【坂本 丞】

Q59 細胞内小器官の輝度を定量したいのですが,細胞質も光っています.画像処理で細胞質の明るさを引き算してよいでしょうか.【村田 隆】

Q60 構造物の形態を計測したいのですが,2値化したときに構造物の輪郭が凸凹になってしまい輪郭を正確に抽出できません.どうすればいいですか?【坂本 丞】

Q61 粒子解析(Particle analyzer)では計数すべき粒子の面積(Size)と円形度(Circularity)の範囲を指定できますが,他の指標も使えないでしょうか?【野中茂紀】

Q62 細胞などの輪郭を抽出したいのですが可能ですか?【小山宏史】

Q63 細胞などの輪郭や繊維状の構造物について,特定の方向のもののみ抽出したいのですが可能ですか?【小山宏史】

Q64 ピクセルで構成されたデジタル画像では,曲線の長さをどのように計測すればいいですか?【小山宏史】

Q65 繊維状の構造物の交点や端点を自動で認識して,計数することはできませんか?【加藤 輝】

Q66 自由曲線上の輝度について計測することはできませんか?【加藤 輝】

Q67 歪んだ構造物の最大径を測りたいです.【加藤 輝】

Q68 波状の模様など周期的なパターンをもった画像の解析によい方法はありませんか?【小山宏史】

Q69 フーリエ変換を用いたフィルタは,周期的・波的なパターンがない画像に適用しても意味はありますか?【小山宏史】

Q70 2種類の分子が共局在しているか評価したいのですが,どのような方法がありますか?【坂本 丞】

Q71 観察対象を追跡する場合,PIVとトラッキングのどちらを使うのがいいでしょうか.【谷口篤史】

Q72 ノイズの除去のために,平均化フィルタ,中央値フィルタ,ガウシアンフィルタなどがあるようですが,使い分ける必要はありますか.【小山宏史】

Q73 解像度変更や画像回転をくり返しても,画質に影響はないですか?【村田 隆】

Q74 対象の組織や細胞が経時的に移動してしまい,さまざまな解析(輝度の定量など)がやりにくいです.位置合わせをすることはできませんか?【小山宏史】

Q75 テスト画像はなぜ重要なのですか? 作成するにはどうすればいいですか?【加藤 輝】

Q76 画像処理の手順やパラメータをチューニングしても,100%の精度をどうしても達成できません.どうすればいいですか?【小山宏史】

Q77 さまざまなソフトウェアに実装されている画像処理法を用いて結果を得たのですが,中身がブラックボックスで不安です.【小山宏史】

Q78 さまざまな画像処理を施していると,自分が何を行ったのかわからなくなることがあります.記録する手段はないでしょうか.【野中茂紀】

第3章 ImageJマクロによる自動化・カスタマイズ

Q79 画像処理の自動化にはどのようなメリットがありますか.【野中茂紀】

Q80 ImageJのレコーダーとは何ですか.【野中茂紀】

Q81 レコーダーを使って自作のマクロを作成したいのですがうまく動きません.どのように修正すればいいでしょうか.【谷口篤史】

Q82 マクロレコーダーで記録しましたが,他の画像の処理にも使えますか?【加藤 輝】

Q83 元画像のファイル名を活用しつつ新たなファイル名を生成するなど,マクロで文字列を操作する簡単な方法はありますか?【加藤 輝】

Q84 多数のROIに対して順番に処理を施したいのですが,マクロで効率的に処理できませんか?【加藤 輝】

Q85 多数の画像に同じ処理を施したいのですが,パラメータの値だけは画像ごとに異なる数値を設定したいです.いい方法はありますか?【加藤 輝】

Q86 マクロでユーザ定義関数を自作したのですが,戻り値として複数の変数を指定することはできませんか?【加藤 輝】

Q87 画像処理で実際にどういった数学的な処理がされているかを自分でマクロを書きながら理解したいのですが,何か手ごろな課題はありませんか?【加藤 輝】

Q88 顕微鏡独自のファイルフォーマットを一括で変換したいです.【加藤 輝】

Q89 テキストファイルを含む任意の種類のファイルをマクロから読み書きする方法について教えてください.【加藤 輝】

Q90 マクロにダイアログ(対話型GUI)を導入したいのですができますか?【加藤 輝】

Q91 多数の画像に対して自動で同じ処理を施すために,マクロを使う以外の方法はありませんか? プログラミングに抵抗があるので….【小山宏史】

Q92 ImageJのマクロとは何ですか? マクロを扱うための基本事項を教えてください.【加藤 輝】

索引

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